PEMISAHAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO DAN PROTEIN

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

            Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah melalui kromatografi lapis tipis (KLT).

              Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa stasioner atau yang lazim disebut sebagai fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut seimbang.

              Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner adalah suatu lembaran tipis silika gel. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fase pelarut, dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu melalui percobaan ini akan dilakukan analisis asam amino dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

1.2  Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1        Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami cara pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu sample melalui metode kromatografi lapis tipis.                     

I.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini yaitu

      1.      Menghitung nilai Rf dari asam amino alanin, histidin dan larutan sampel

      2.      Menentukan jenis asam amino yang terkandung dalam suatu sampel.

1.3 Prinsip Percobaan

Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari campuran n-butanol, asam asetat dan air, sedangkan fase diamnya adalah plat KLT yang merupakan lempeng aluminium yang dilapisi dengan zat padat, umumnya adalah aluminia, silika gel, dan selulosa.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat sebagai komponen protein mempunyai gugus –NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus –COOH. Dari rumus umum tersebut dapat dilihat bahwa atom karbon α ialah atom karbon asimetrik, kecuali bila R ialah atom H. Oleh karena itu asam amino juga memiliki sifat memutar bidang cahaya terpolarisasi atau aktivitas optik. Rumus molekul dapat digambarkan dengan model bola atau batang dengan rumus proyeksi Fischer. Oleh karena atom karbon itu asimetrik, maka molekul asam amino mempunyai dua konfigurasi D dan L. Hal ini dapat dibandingkan dengan konfigurasi molekul monosakarida (Poedjiadi, 1994).

Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri sama, gugus karboksil dan gugus amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada rantai sampingnya, atau gugus R, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan di dalam air. Ke-20 asam amino pada protein seringkali dipandang sebagai asam amino baku, utama, atau normal, untuk membedakan molekul-molekul ini dari jenis-jenis asam amino lain yang ada pada organisme hidup, tetapi tidak terdapat di dalam protein. Asam amino baku dapat dinyatakan dengan singkatan tiga huruf atau lambang satu huruf, yang digunakan sebagai cara ringkas untuk menunjukkan komposisi dan urutan asam amino di dalam rantai polipeptida (Lehninger, 1982).

Suatu peptida adalah senyawa yang dibentuk dari asam α-amino yang terikat oleh suatu ikatan peptida. Asam-asam amino dalam peptida disebut sebagai unit peptida atau residu asam amino. Suatu peptida yang dibentuk dari dua residu asam amino dipeptida, sedangkan bila dari tiga residu asam amino disebut tripeptida. Suatu polipeptida adalah suatu peptida dengan banyak residu asam amino. Perbedaan antara suatu polipeptida dengan protein adalah berdasarkan perjanjian, umumnya suatu polipeptida dengan 50 residu asam amino disebut sebagai protein. Asam amino mempunyai sebuah asam karboksilat dan gugus α-amino dalam sebuah molekul. Akibatnya, suatu asam amino akan mengalami reaksi asam basa dalam molekulnya, untuk membentuk suatu ion dipolar, yaitu suatu ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Ion dipolar disebut juga sebagai zwitter ion. Suatu ion dipolar mempunyai muatan positif dan negatif sehingga muatan listriknya netral. Walaupun netral, tetapi ion dipolar masih merupakan senyawa ion. Terlihat dari sifat-sifat fisiknya, misalnya: titik didihnya tinggi, dapat larut dalam air, tetapi hampir tidak larut dalam pelarut organik. Sifat-sifat ini tidak ada bila ion dipolar tidak memiliki muatan ion (Fessenden dan Fessenden, 1997).

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti pada eter, aseton dam kloroform. Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan asam amino. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom karbon umunya kurang larut dalam air tetapi larut pelarut organik (Poedjiadi, 1994).

Asam amino yang diperoleh dari larutan hidrolisis protein adalah asam amino α. Artinya, gugus amino berada pada atom karbon α, yaitu disebelah gugus karboksil. Kecuali glisin, dengan R = H, asam amino α memiliki pusat stereogenik pada karbon α. Dengan demikian, semua asam amino α kecuali glisin bersifat aktif opti (Hart, dkk., 2003).

 

Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagaiion amonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai ion karboksilat. Struktur dipolar ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh yang agak tinggi (bahkan yang paling sederhana, glisina, meleleh pada suhu 233°C) dan kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah). Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil (Hart dkk., 2003).

            Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetrik, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis.  Salah satu metode yang paling banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi.  Macam-macam kromatografinialah kromatografi kertas, kromatogrfi lapis tipis, dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).

Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi, yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit demi sedikit pada kertas kromatografi pada pada titik tertentu (A) dan kemudian ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain, dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut kan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatu asam amino tertentu (b), dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh suatu pelarut dari garis awal hingga garis akhir (a) diberi lambang R_f. Harga R_f yaitu b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui macamnya pada kromatografi kertas seperti yang telah dilakukan di atas, dapat diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan macam asam amino dapat pula dilakukan dengan menghitung harga R_f asam amino yang terdapat pada tabel yang ada (Poedjadi, 1994).

            Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera populer karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu analisis cepat dan daya pisah yang cukup baik.  Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep “lempeng teori” lebih sukar digambarkan di sini, tetapi jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan bermuatan cuplikan dalam dua fasa, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal. Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi, R_f.

 

Jarak yang tempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak tempuh cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksimum. Definisi koefisien distribusi K adalah perbandingan dengan kadar senyawa tersebut dalam fasa gerak C_m dan kadar senyawa terlarut dalam fasa diam C_s,,

                                 K = C_s / C_m

Fasa diam

Pada semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk sebuah pemisahan merupakan hasil kecocokan antara fasa diam dan fasa gerak. Dalam KLT, fasa diam harus mudah didapat, keistimewaan KLT adalah lapisan tipis fasa diam dan kemampuan pemisahannya.

Fasa gerak

Pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan fasa diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan. Jika fasa gerak digunakan sistem pelarut campuran, pada fase diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi sedikit. Suatu pendekatan yang menarik terhadap penggunaan campuran azeotrop, misalnya metanol – aseton (12 : 88), metanol – benzena (31,7 : 68,3) metanol – sikloheksana – metilasetat (17,8 : 33,6 : 48,6) hal ini mempengaruhi kualitas pemisahan dan kedapat – ulangnya adalah kejenuhan bejana pengembang (Soedjadi, 1988)

            TLC digunakan untuk memantau kemajuan reaksi dan untuk mengenali komponen tertentu.  Teknik ini sering dilakukan dengan lempengan gelas atau plastik yang dilapisi fase diam. Fase gerak cair adalah pelarut.  Campuran yang akan dianalisis diteteskan pada dasar lempengan, dan pelarut akan bergerak naik oleh gaya kapiler (Bresnick, 2004).

            Analisi asam amino ditentukan oleh tipe asam amino dan berapa banyak penyusun protein.  Hanya komposisi asam amino yang ditentukan, bukan deret residu asam aminonya.  Analisis asam amino dapat dibagi menjad empat langkah dasar :

1.      Hidrolisis suatu asam amino menjadi konstituen asam amino tersendiri.

2.      Menandai asam amino dengan deteksi serapan UV atau penghasil flouruesen.

3.      Memisahkan jenis asam amino yang berbeda dengan kromatografi.

4.      Mengukur banyak relatif tiap asam amino pada intensitas pada penghasil deteksi yang bergabung dengan asam amino dari sistem kromatografi.

Banyak pengembangan yang telah dilakukan beberapa tahun belakangan ini  untuk meningkatkan teknik analisis asam amino.  Diantaranya sistem kromatografi penukar ion telah dioptimalkan dengan merubah karakter resin, ukuran kolom, suhu kolom, pH bufer dan ion kuat untuk meningkatkan resolusi  (pemisahan kromatografi) dan menurunkan sample (lebih sensitif) (Page,2010).

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat (H₂SO₄) (Anonim, 2010).

            Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang diuji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol (Anonim, 2010).

                                

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

            Bahan yang digunakan yaitu eluen (n-butanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v), larutan ninhidrin 0,2 %, larutan histidin, larutan alanin, larutan serin, larutan sampel, plat kromatografi, aseton, akuades, tissue roll, dan isolasi.

3.2 Alat Percobaan

         Alat yang digunakan yaitu chamber, labu semprot, pipa kapiler 0,5 µL, filter, pipet ukur 0,2 mL; 0,5 mL, pipet volume 1 mL, gelas ukur 25 mL, mistar, oven, gunting,  pensil.

3.3 Prosedur Percobaan

      Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n – butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Kemudian dimasukkan eluen ke dalam chamber, dikocok sebentar, kemudian ditutup dan ditunggu sampai jenuh. Lalu dibuat base line pada plat KLT yang berukuran 9 cm x 3 cm, dan membuat titik-titik pada base line yaitu histidin, alanin dan sampel serta membuat garis pada ujung atas absorben sebagai batas tanda elusi. Ditotolkan histidin pada salah satu titik base line, demikian juga untuk alanin dan sampel dengan menggunakan pipa kapiler yang sebelumya telah dicuci dengan aseton kemudian dikeringkan. Jika eluen telah jenuh, plat KLT dielusi ke dalam chamber dengan hati-hati agar base line tidak tercelup ke dalam eluen. Elusi dihentikan jika eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya. Dikeluarkan absorben dari chamber dan dikeringkan. Selanjutnya  kromatogram disemprot dengan larutan ninhidrin, kemudian dikeringkan dalam inkubator dengan suhu kurang lebih 60°C selama setengah jam.Setelah kering diberi tanda pada noda yang timbul pada kromatogram dengan pensil. Ditentukan nilai R_f dari masing-masing noda pada kromatogram.

 

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASN

4.1 Hasil Pengamatan

            Percobaan ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya larutan yang mengandung asam amino dengan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis, yang melibatkan perhitungan nilai Rf dari masing-masing larutan yang mengandung asam amino.

         Teknik kromatografi lapis tipis yang digunakan dalam percobaan ini mempunyai kelebihan, yaitu dapat dilakukan proses identifikasi lebih lanjut, dengan mengeruk silika gel (noda larutan contoh), kemudian dilanjutkan dengan identifikasi menggunakan teknik kromatografi kolom.

4.1.1 Tabel Hasil Pengamatan

Noda	Jarak eluen (cm)	Jarak noda (cm)	Rf (cm)
Serin	6,5	2,3	0,35
Asam Aspartat	6,5	3,3	0,50
Glisin	6,5	2,2	0,33
Sampel	6,5	4,5	0,69

\

4.1.2 Reaksi

a.          Reaksi Serin dengan ninhidrin

serin

 

+  3 H₂O

b.         Reaksi Serin dengan ninhidrin

4.1.3 Pembahasan

            Pada percobaan ini kita menggunakan plat kromatografi berukuran 7.5 x 5 cm. Pada plat kromatografi kita membuat base line yang digunakan sebagai tempat menotol larutan asam amino dan sampel yang berjarak 1 cm dari tepi bawah plat kromatografi. Jarak tempuh eluen pada kertas kromatografi kita buat sepanjang 6,5 cm. Plat kromatografi ini adalah fase diam dalam percobaan ini. Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan interaksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga

Dalam percobaan ini, identifikasi asam amino dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Agar diperoleh pemisahan asam amino yang baik, digunakan tiga fase pelarut, yaitu n-butanol – asam asetat – aquades yang bertindak sebagai eluen dengan perbandingan volume yang telah ditentukan sebelumnya. Kesalahan dalam perbandingan volume dapat mempengaruhi efisiensi pemisahan.

            Plat KLT ditotol dengan larutan sampel dan larutan asam amino (serin, glisin, asam aspartat dan fenilalanin). Adapun penggunaan larutan asam amino dalam percobaan ini ialah sebagai alat pembanding dengan larutan asam amino yang akan diidentifikasi.

Adapun dalam percobaain ini larutan harus dijenuhkan terlebih dahulu, karena aquades dalam sistem pelarut merupakan penghambat naiknya pelarut organik pada plat KLT. Faktor-faktor tersebut menyebabkan waktu elusi yang digunakan sangat lama. Aquades bertindak sebagai fasa diam, sedangkan pelarut organik bertindak sebagai fasa gerak.

            Pada percobaan ini disiapkan absorben yang kering agar mampu menyerap noda larutan sampel dengan baik, proses penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler karena sampel yang akan dianalisis hanya dibutuhkan sedikit (uji kualitatif) serta dilakukan secara hati-hati dan diusahakan noda tidak melebar di absorben, teknik double spotting dilakukan agar ketelitian proses pengukuran R_f dapat ditingkatkan. Eluen yang terdapat di dalam gelas merupakan campuran dari n-butanol, asam asetat, dan air. Campuran ini berfungsi agar setiap asam amino dengan gugus yang berbeda dapat diidentifikasi.  Adapun dipilih campuran dari bahan tersebut karena memiliki perbedaan kepolaran dengan urutan kepolaran yaitu air > n-butanol > asam asetat. Pada percobaan ini proses elusi berjalan cukup lambat, proses elusi berakhir (eluen sampai pada end line) kurang lebih 1 jam. Setelah absorben diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan pada suhu kamar dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin, maka akan muncul dua warna dominan dalam identifkasi asam amino, yaitu ungu dan jingga yang merupakan warna senyawa kompleks yang dibentuk oleh larutan asam amino dan sampel yang diidentifikasi. Untuk memperjelas noda yang terbentuk maka absorben dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 80°C, selama 10-15 menit, kemudian dilakukan proses pengukuran jarak eluen dan jarak noda dari tempat penotolan.

         Pada percobaan ini digunakan plat KLT silika bukan alimina, karena pada plat KLT silika mempunyai sifat nonpolar sedangkan pada percobaan ini digunakan asam amino yang bersifat polar. Di gunakan silika, agar dapat diidentifikasi reaksi yang terjadi pada percobaan ini.

         Dari percobaan dapat diketahui bahwa  sampel 1 memiliki R_f yang hampir sama dengan alanin, dapat diambil sebuah hipotesa bahwa sampel 1 adalah fenilalanin atau senyawa asam amino yang mempunyai gugus fungsi mirip dengan alanin karena selain nilai Rf juga dilihat dari warna yang ditimbulkan yaitu jingga. 

BAB V

SARAN DAN KESIMPULAN

5.1  Kesimpulan

1.        Dari percobaan yang telah dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa nilai R_f  untuk asam amino serin yaitu 0,35, asam amino asam aspartat yaitu 0,50, asam amino glisin yaitu 0,33 dan nilai Rf sampel yaitu 0,69.

2.        Dari percobaan, juga diketahui bahwa sampel x adalah asam amino fenilalanin karena memiliki nilai Rf standar yang hampir sama dengan asam amino fenilalanin.

5.2       Saran

            Sebaiknya larutan contoh yang diidentifikasi diperbanyak agar dapat diketahui R_f dari asam amino selain histidin dan alanin dan juga gunakan teknik identifikasi dan pemisahan asam amino yang lain. Dan untuk asisten pertahankan cara mengajarnya.

 

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010, Kromatografi Lapis Tipis (online), (www. Nv.cc.va.us/alexandria/science/chromatografy.html, diakses 16 April 2012 pukul 17.00 WITA).

Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, Hipokrates, Jakarta.

Fessenden, RJ. Dan Fessenden, S., 1986, Kimia Organik, Edisi Ketiga, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana, Erlangga, Jakarta.

Hart, H., Craine, L. E., dan Hart, J. D., 2003, Kimia Organik edisi kesebelas, diterjemahkan oleh Suminar Setiati Achmadi, Erlangga, Jakarta.

Lehninger, A. L., 1995, Dasar-dasar Biokimia jilid I, diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaya, Erlangga, Jakarta.

Page, D., S., 1998, Prinsip-prinsip Biokimia, Erlangga, Jakarta.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Soedjadi, 1988, Metode pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.

Yuliati, A., 2005, Identifikasi epitop dari Streptococcus Mutans Terhadap Sekreyori Imunoglobulin A Saliva, Jurnal Bagian Ilmu Material dan Teknologi Kedokteran Gigi  (online), 3 (Volume 38), halaman 103-107 (journal.unair.ac.id/filterPDF/DENTJ-38-3-01.pdf, diakses pada tanggal 16 April 2012 puku; 20.00 WITA.)

LEMBAR PENGESAHAN

                                                                                 Makassar, 18 April  2012

    ASISTEN                                                                  PRAKTIKAN

ASMAN KUMIK                                                    ISMIYATI H YUSUF